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INITRODUKTION

Tiermodelle spielen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von Medikamenten und der Untersuchung molekularbiologischer Mechanismen. In der Vergangenheit war das durch Steinkohlenteer induzierte Hautkrebsmodell am Kaninchen der Auslöser für die Entwicklung eines Karzinogen-induzierten Mausmodells. Verschiedene Tiermodelle wurden als Bewertungsinstrument für die Vorhersage von Karzinogenen und die Untersuchung karzinogener Mechanismen eingeführt (1). Der Ansatz, ein Karzinogen chronisch zu exponieren, ist jedoch zeit- und kostenintensiv, was seine Anwendung in der Arzneimittelentwicklung einschränkt. Dennoch sind Mausmodelle aufgrund der geringen Kosten, der einfachen Handhabung und der bekannten genetischen Informationen immer noch attraktiver als große Tiermodelle (2). In jüngster Zeit wurde ein syngenes Mausmodell entwickelt, dem murine Zelllinien injiziert werden (3). Die Vorteile dieses Modells liegen in der Reproduzierbarkeit, der Fähigkeit, verschiedene Tumorarten leicht zu induzieren, und der Immunkompetenz. Andererseits zeigt dieses Modell häufig eine andere Reaktion als die Ergebnisse von In-vitro-Tests mit menschlichen Krebszellen. Um diesen Nachteil zu überwinden, verwendete das National Cancer Institute (NCI) eine Methode, bei der menschliche Krebszellen in eine immunschwache Maus injiziert werden. Aus acht verschiedenen NCI-Krebszelllinien (Gehirn, Dickdarm, Leukämie, Lunge, Melanom, Eierstock, Prostata und Niere) wurde eine Reihe von Xenotransplantationsmodellen entwickelt. Darüber hinaus wurden verschiedene Methoden zur Erzeugung von Mausmodellen für die Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität neuer Arzneimittel entwickelt. Ein Modell ist das gentechnisch veränderte Mausmodell (GEMM), das eine fortschrittliche Methode zur Bewertung der Mechanismen der Krebsentstehung und der Arzneimittelresistenz darstellt (4). Für das GEMM-Modell werden immunkompetente Mäuse verwendet, ähnlich wie bei einem syngenen Modell. Daher ermöglicht dieses Modell die Entwicklung von Immunadjuvantien für Krebs. Außerdem ist dieses Modell nützlich für die Aufklärung biologischer Prozesse und die Untersuchung von Tumorzellen und ihrer Mikroumgebung, aber es ist sehr teuer, heterogen und kompliziert. Hinzu kommt, dass Häufigkeit, Entwicklung und Wachstum von Tumoren im GEMM-Modell nicht übereinstimmen (4-7). Viele Forscher haben eine Strategie für die präklinische Bewertung entwickelt, um das therapeutische Potenzial zu bestimmen und die menschliche Tumorumgebung nachzuahmen. Neben dem GEMM-Modell werden in vivo Xenograft-Modelle mit athymischen Nacktmäusen und Mäusen mit schwerer kombinierter Immunschwäche (SCID) verwendet, um menschliche Krebszellen oder Tumorgewebe von Patienten in der translationalen Forschung für klinische Studien zu implantieren (8,9). In dieser Übersicht werden die Arten und Merkmale der Tumor-Xenograft-Modelle auf die Verwendung bei der Entwicklung von Krebsmedikamenten ausgerichtet.

Ektopisches Tumor-Xenograft-Modell. Im Allgemeinen werden menschliche Krebszellen subkutan in das Hinterbein oder den Rücken von Mäusen injiziert (Abb. 1A). Bei einem ektopischen Tumor-Xenograft-Modell (ektopisches Modell) unterscheidet sich der Transplantationsort vom Ursprung der gezüchteten Zellen. Das ektopische Modell ist das Standardmodell für Krebs, das zur Validierung und Bewertung in onkologischen Studien verwendet wird. Nach der Etablierung von Krebszelllinien für das Krebs-Screening im NCI wurden von diesen Zelllinien abgeleitete Xenograft-Modelle entwickelt. Sechzig Zelllinien aus acht Organen wurden für die Erstellung von Xenotransplantationsmodellen verwendet, und es wurden Informationen wie die Verdopplungszeit des Tumors und die Tumorigenitätsrate berichtet (1). Tabelle 1 zeigt, dass bei menschlichen Krebszelllinien die reproduzierbare Entnahmerate des Xenotransplantatmodells bei über 90 % lag. Für die Bewertung von Leitverbindungen aus einem In-vitro-Screening-Test hat dieses Modell gezeigt, dass die gleichen Krebszellen nützlich und prädiktiv sein können, was für die Auswahl einer geeigneten Krebsverbindung für die Umsetzung in klinische Studien hilfreich ist.

Da ein ektopisches Modell zur einfachen Überwachung der Tumorigenität und des Tumorwachstums verwendet werden kann, haben viele Forscher dieses Modell zur Bewertung der Wirksamkeit von Krebsbehandlungen eingesetzt (10-12). Das Tumorvolumen (V) wird aus der größten Länge und der kürzesten Länge des Tumors berechnet (Gleichung 1). Anhand mehrerer Parameter, die auf diesen Daten basieren, kann die Krebsbekämpfungsaktivität bewertet werden. Das Verhältnis zwischen der behandelten Gruppe (T) und der Kontrollgruppe (C) (optimaler Prozentsatz T/C), die Verzögerung des Tumorwachstums und die Rückbildung des Tumors wurden herangezogen (13-15). Die arzneimittelbedingten Todesfälle (DRD) und die Veränderung des Körpergewichts wurden als Parameter der Toxizität bestimmt. Bei DRD wurde davon ausgegangen, dass die Tiere innerhalb von 15 Tagen verstarben, und ein Verlust von mehr als 20 % des Körpergewichts der behandelten Mäuse im Vergleich zur Kontrollgruppe wurde als unerwünschte Wirkung angesehen.

Diese Parameter helfen dabei, den Leitwirkstoff aus dem Wirkstoffscreening zu ermitteln. Gelegentlich kann das Ansprechen auf ein Medikament je nach Krebsart ohne individuelle Unterschiede verglichen werden, da zwei Arten von Krebszellen spontan in dieselbe Maus transplantiert werden können und die beiden Tumore Unterschiede im Wachstum aufweisen können (16). Darüber hinaus ist das ektopische Modell sehr reproduzierbar, homogen und einfach zu verwenden.

Allerdings können nicht alle Tumore als Bewertungsinstrument verwendet werden, da einige Tumore während der Tumorigenität Nekrose zeigen und einige Tumore nicht solide (substanzlos) sind. Die immunsupprimierten Mäuse, die für die Herstellung von Tiermodellen verwendet werden, stellen eine andere Mikroumgebung dar als die von menschlichem Krebs. Daher ist die Bewertung von Invasion und Metastasierung in diesem Modell begrenzt.

Orthotopisches Tumor-Xenograft-Modell. Es wurden alternative Modelle zur Bewertung der Tumorsensibilität entwickelt. Das orthotopische Tumor-Xenograft-Modell (orthotopisches Modell) ist ein fortschrittliches Instrument, basiert jedoch auf einer immunsuppressiven Maus-Mikroumgebung. Beim orthotopen Modell werden die menschlichen Krebszellen an denselben Ursprungsort des Tumors transplantiert. Für das orthotopische Modell wurden zum Beispiel Lungenkrebszellen direkt in die Mauslunge injiziert (Abb. 1B). Bei diesem Modell ist ein gut ausgebildeter Experte mit chirurgischen Fähigkeiten erforderlich, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Die Entnahmerate der Tumorigenität ist schwer zu berechnen, da fast alle Tumoren außer Melanomen mit bloßem Auge nicht zu erkennen sind. Darüber hinaus sind orthotope Modelle im Gegensatz zu subkutanen ektopischen Modellen auf die Messung des Tumorwachstums ohne Opferung beschränkt. Bisher ist die Bildgebung die Methode der Wahl, um das Fortschreiten des Tumorwachstums in orthotopen Modellen zu überwachen. Derzeit werden orthotopische Modelle mit Krebszelllinien, die Fluoreszenz oder Luziferase exprimieren, durch optische Bildgebung, Computertomographie (CT) oder Magnetresonanztomographie (MRT) beobachtet (17). Um die Karzinogenese zu beurteilen und das Tumorwachstum ohne Opfer zu bestimmen, sind teure Geräte erforderlich, so dass dieses Modell nur begrenzt verfügbar ist. Dennoch ist dieses Modell klinisch relevant für den patientenähnlichen Progressionsprozess (z. B. Invasion). Nach dem Bericht von Ho und seinen Kollegen zeigen orthotope Tumoren im Vergleich zu ektopischen Tumoren ein schnelleres Tumorwachstum im Frühstadium, eine schnellere Angiogenese und eine höhere Permeabilität der Blutgefäße (18). Bei einigen Krebsarten wurde auch eine Metastasierung beobachtet. So ist das orthotope Brustdrüsenfettpolstertumorimplantatmodell auch ein gutes Modell für Brustkrebs. In diesem Modell ähneln spontane Tumormetastasen dem natürlichen Verlauf des menschlichen Brustkrebses (19). Daher konnten die krebshemmende Wirkung und die Hemmung der Metastasierung im selben Modell untersucht werden. Das Metastasierungsmodell wird im Folgenden ausführlich beschrieben.

Metastasierendes Krebsmodell. Tumore, die sich lokal durch die Exposition gegenüber ultravioletter, ionisierender Strahlung und Karzinogenen bilden, zirkulieren durch Invasion in Gefäßen und Lymphknoten und verursachen Metastasen (sekundären Krebs) an Stellen, die für eine Invasion zugänglich sind. Nach der Samen-Boden-Hypothese von Paget initiiert die primäre Krebszelle (Samen) die Metastasierung in einer geeigneten Umgebung (Boden) wie Lunge, Leber, Knochen, Lymphe und Gehirn (20). Die jüngste Forschung hat die Entwicklung von Metastasierungshemmern und präventiven Medikamenten auf der Grundlage von Studien über die Mechanismen der Metastasierung vorangetrieben, aber es gab kein präklinisches Bewertungsinstrument, um Richtlinien für die Genehmigung einer klinischen Studie festzulegen.

Für die Etablierung eines Metastasierungsmodells wurden verschiedene Methoden entwickelt, und es gibt zwei Arten von menschlichen Xenotransplantationsmodellen. Bei der orthotopen Transplantation entstehen aus den transplantierten Tumorzellen der Primärtumor, der Tumor wird entfernt, und dann wird die Metastasierung beobachtet. So wurden beispielsweise WM239-Melanomzellen in Mäuse mit schwerer kombinierter Immundefizienz (SCID) transplantiert, und der Primärtumor wurde nach 4 Wochen isoliert. Anschließend wurde eine Lungenmetastasierung beobachtet (21). Das orthotopische Modell wurde aus Prostatakrebszellen (DU145) hergestellt, und der entfernte Lymphknoten wurde kultiviert und isolierte Tumorzellen wurden Mäusen erneut injiziert, um ein Metastasierungsmodell zu erhalten (22). Zweitens wurden Krebszellen intravenös in Nackt- (Abb. 1C) oder SCID-Mäuse injiziert, wo sie wie Krebsstammzellen zirkulierten und eine Metastasierung auslösten (23). Dieses Modell wird schneller generiert als das erste Modell. Beim Hybridmodell aus ektopischem und orthotopischem Modell werden fluoreszenzexprimierende HT-29-Zellen (menschlicher Dickdarmkrebs) subkutan in die ektopische Stelle injiziert und mehrere Stücke von aus HT-29-Zellen abgeleiteten Tumoren in den Dickdarm transplantiert, woraufhin die Metastasierung beobachtet wird (24). Im Allgemeinen ist ein Metastasierungsmodell in SCID-Mäusen leichter zu erhalten als in Nacktmäusen. Da die Metastasierung, wie im orthotopen Modell, außer bei Hautkrebs (25) nur schwer zu beobachten ist, wurden gentechnisch veränderte Zelllinien (Fluoreszenz- (24) oder Luciferase-exprimierende Zellen (26)) verwendet und mittels optischer In-vivo-Bildgebung überwacht. Dieses Modell wird häufig für die Diagnose eingesetzt, wobei die Bildgebung mittels MRT oder Positronen-Emissions-Tomographie (PET) (27) erfolgt, um gleichzeitig eine Diagnose zu stellen und die geeignete Krebstherapie zu bestimmen. Bislang gibt es noch keine Leitlinien für die Verwendung der Metastasierung als Bewertungsinstrument für die Arzneimittelentwicklung. Weitere Studien zur Reproduzierbarkeit, zu den Mechanismen, die der Metastasierung zugrunde liegen, und zu den Markern sind erforderlich.

Patienten-Tumor-Xenograft-Modell. Xenotransplantatmodelle sind trotz ihrer Vorteile nur begrenzt in der Lage zu zeigen, wie ein Krebspatient auf eine bestimmte Behandlung ansprechen würde. Die zuverlässige Vorhersage des Ansprechens auf ein Medikament in einer klinischen Studie ist notwendig, und die derzeitigen Modelle sind nicht ausreichend. Um die Unzulänglichkeiten dieser Modelle zu beheben, wurde ein vom Patienten stammendes Tumor-Xenograft (PDTX) entwickelt und eingesetzt (28,29). Da bei PDTX Gewebe von Krebspatienten direkt in immungeschwächte Mäuse transplantiert wird (Abb. 1D), sind die genetischen Informationen und immunhistologischen Marker mit denen des Patienten korreliert und können zur Bewertung neuer Krebsmedikamente (30) und personalisierter Krebstherapien verwendet werden. Die verschiedenen Vorteile von PDTX lassen sich wie folgt zusammenfassen: 1

Das PDTX-Modell unterliegt jedoch technischen Beschränkungen und ist teuer und zeitaufwändig. Vor allem müssen frisch exzidierte menschliche Primärtumore innerhalb weniger Stunden vom Operationssaal ins Labor gebracht werden. Gleichzeitig sollte eine Probe der menschlichen Primärtumore durch immunhistologische Analyse untersucht werden. Daher ist eine Zusammenarbeit zwischen dem Chirurgen, dem Histologen und dem Forscher erforderlich. Dann können die ursprünglichen menschlichen Primärtumore mit dem Tumorgewebe des passagierten Tumortransplantats verglichen werden. Außerdem ist die Genehmigung eines institutionellen Prüfungsausschusses (IRB) erforderlich, da die Verwendung von Tumorgewebe von Patienten klinische und ethische Überlegungen nach sich zieht. Ungeachtet dieser Bemühungen liegt die Entnahmerate von PDTX bei etwa 25 % (31-33), und die Etablierung von PDTX dauert etwa drei Monate bis zur ersten Passage (Daten nicht gezeigt). Wie bei der Xeno-Organ-Transplantation ist die erste Transplantation in SCID-Mäuse erforderlich, um einer akuten Immunabstoßung zu entgehen, und das ist teuer. Außerdem ist das Volumen des vom Patienten stammenden Tumorgewebes sehr begrenzt, so dass die Anzahl der PDTX-Populationen durch die Passage von Tumorgewebe erhöht werden sollte, wobei jede Passage von Tumorgewebe histopathologisch analysiert und mit dem ursprünglichen Gewebe verglichen werden sollte. Ab der zweiten Passage können Nacktmäuse verwendet werden. Die Tumorgewebestücke können eingefroren und in flüssigem Stickstoff konserviert werden.

Trotz dieser Hürden steht das etablierte PDTX-Modell für die Validierung der Empfindlichkeit gegenüber Krebsmedikamenten und die Vorhersage der Patientenprognose zur Verfügung. PDTX ist sicherlich ein äußerst vielversprechendes Modell für die personalisierte Krebstherapie. Dementsprechend bemühen sich globale Forschungszentren um den Aufbau einer PDTX-Ressourcenbank. In den letzten zehn Jahren hat sich das PDTX-Modell rasch entwickelt. Dieses Modell ist ein vielversprechendes Instrument für die Entwicklung von Krebsmedikamenten und prädiktiven Biomarkern.