12.9.2 Cross-linking
明らかに利点はあるものの、生体足場の使用には多くの問題、特に生体内で急速に生分解し、免疫原性に関する懸念、意図しないまたは不完全な組織反応などが存在する。 これらの懸念を払拭するために、数十年にわたり架橋方法が採用されてきた。 架橋は、生分解を遅らせるだけでなく、ECM 足場の構造タンパク質に対する異種反応を排除または低減する役割を果たします (Courtman et al., 2001)。 ホルムアルデヒド処理から移行し、生体人工心臓弁のグルタルアルデヒド架橋を導入したことは、この分野における大きな業績と考えられています（Zillaら、2007年）。 架橋は生体心臓弁の非血栓性表面を維持し、抗原性を低下させ、劣化を防ぐことにより、生体内での寿命を延ばすことができます。 このような生体心臓弁の固定方法は、現在でも使用されています。 実際、コラーゲンのクロムなめしは、皮革産業における動物の皮の保存に100年以上使われている（Covington, 1997）。 このプロセスでは、クロム種とコラーゲンの間にイオン結合、共有結合、水素結合が起こる。 このような生体材料の安定化は、外科用縫合材料としてクロミックキャットガットの製造にも利用されてきた（Van Winkleら、1975）。 他の様々な形式の架橋剤が存在し、主に生体人工心臓弁および心膜組織のin vivoでの性能を向上させ、石灰化および細胞毒性に関連する障害を克服する必要性から開発された。 架橋剤には、よく知られたアルデヒド類（ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド）から、ポリエポキシ化合物やヘキサメチレンジイソシアネートなどの新しい二官能性架橋剤まで、さまざまなものがある。 その他の最新の架橋剤には、アシルアジドやカルボジイミドなどのゼロ長架橋剤がある（Khor, 1997）。 グルタルアルデヒド架橋は、生物学的足場を安定化するために依然として使用されているが、より新しい機能的で、おそらく細胞毒性の低い架橋方法が開発されてきている。 これらには、微生物のトランスグルタミナーゼ酵素、ハーブ化合物のゲニピン、および多機能性デンドリマー架橋が含まれる（Garciaら、2007b；Duanら、2007；Changら、2002；Chanら、2007）。
患者の寿命を超えることを意図した非分解性の人工関節の使用から、損傷または病気の器官を修復するために、時間の経過とともに生体内で再構築されるように設計された生分解性足場への移行がある（Brody and Pandit, 2007; Badylak, 2007）。 足場の分解は、生体内の組織再生の速度に合わせて制御され、並行して行われる必要があります（Burugapalli et al.） また、組織工学に用いられる生分解性スキャフォールドは、新たに形成される組織がその機能を担うまで、必要な機能を提供しなければならない。 理想的な生分解性足場では、宿主細胞が移植された足場に侵入して住み着くと、新しい細胞外マトリックスを分泌して、所定の速度で分解する元の足場と置き換わる。
生体足場のin vitroおよびin vivoでの分解の速度は、架橋の程度によって調整できることが示されている（Burugapalli et al.） Liangら（2004）は、ゲニピンで架橋した牛の心膜を使用して、組織反応と再生パターンに対する架橋度の影響を調べた。 ラットの皮下移植モデルにおいて、彼らは、非架橋および最小限の架橋を施した非セルラー牛心膜は、新しい組織の形成が起こる前に急速に分解されることを見出した。 一方、中程度に架橋された足場と高度に架橋された足場では、新しいコラーゲンの形成が観察されたが、後者では分解に対する抵抗力が強いため、この過程は足場の外層に限定された。 同様の足場がイヌのモデルで血管パッチとして移植されたとき（Changら、2004）、内皮の無傷の層が、宿主の線維芽細胞および平滑筋細胞とともに、無細胞の移植片の内表面に見いだされました。 このことは、この研究で用いられたグルタルアルデヒドで架橋されたアセラーウシ心膜では、より少ない程度で発生した。 しかし、意図しない内膜の肥厚と軟骨の形質転換は、両方の足場タイプで観察された。 別の研究において、同様のゲニピン架橋アセラーウシ心膜が、ラット右心室モデルにおける心筋欠損の修復に用いられた（Changら、2005年）。 心内膜表面には、内皮細胞に覆われた内膜肥厚が認められた。 また、グラフト外表面には中皮細胞が観察され、癒着に抵抗していると考えられる。 移植後4週目には、平滑筋細胞、新筋繊維、新コラーゲン、新グリコサミノグリカン、新毛細管が足場内に観察された。
ゼラチンは、末梢神経欠損の修復に生体材料として用いられてきた（Mligilicheら、1999; Gamezら、2004)。 ゼラチンから調製され、ゲニピンで架橋された分解性スキャフォールドは、管状シリコンチャンバーの充填材として用いられ、ラットの10mmの坐骨神経ギャップを越えて神経再生を導くための細胞外マトリックスとして機能した（Liuら、2004年）。 充填物の残渣が軸索の移動・伸長を阻害することが示され（Verduら、2002）、これはゼラチン充填物の分解時間の延長に起因すると考えられた（Bigiら、2002；Liuら、2004）。 架橋ゼラチンをチューブ状の導管として（充填材としてではなく）用い、同様の神経ギャップを橋渡ししたところ、導管が分解し始め新生血管が増加する6週目に、周囲のシュワン細胞とほとんど無髄軸索を含む再生神経線維がギャップ全体に認められた（Chenら、2005年）。 再生神経の外側の領域には、高密度の瘢痕組織も見られた。 皮下移植後、予想される急性および慢性炎症反応とともに、線維性カプセルの薄い層が観察された。
架橋ゼラチン-リン酸三カルシウム足場を皮下移植したとき、架橋の濃度がin vivoでの分解を決定することがわかった（Yaoら、2004年）。 架橋度の低い足場は劣化が大きく、架橋度の高い足場はin vivoでの劣化が最小限であった。 高架橋の使用はまた、架橋の細胞毒性に起因するインプラント繊維性カプセルの形成の増加と関連していました。 同様の足場がウサギの頭頂骨欠損を修復するために移植されたとき、著者らは、このプロセスが骨-足場界面においてのみ限定されるにもかかわらず、足場が徐々に分解されて新しい骨に置き換えられることを見出した（Yaoら、2005年）。 グルタルアルデヒドで架橋された同じ複合材料は、同様の反応を引き起こした（Chenら、1998）。 足場が新しい骨によって置換され、そして欠損の端から遠心的に細胞マトリックスが敷設されるにつれて、複合足場の漸進的な分解が存在した。 工学的足場は重要かもしれないが、他の要因も治癒過程を加速させることができる。 例えば、高気圧酸素療法の追加は、放射線学的および組織形態学的技術によって示されるように、新しい骨形成を大幅に増加させた（Chenら、2004年）。 分解性足場におけるBMP-2のような生物活性因子の存在は、皮下および筋肉内の異所性骨形成を誘発し、破骨細胞の作用による吸収を加速するように見えた（Liangら、2005；Takahashiら、2005；Katoら、2006；Yonedaら、2005）
。