Free Press

INLEDNING

Djurmodeller spelar en viktig roll för läkemedelsutveckling och studier av molekylärbiologiska mekanismer. Historiskt sett har modellen för hudcancer orsakad av stenkolstjära hos kanin utlöst utvecklingen av en cancerinducerad musmodell. Olika djurmodeller har etablerats som ett utvärderingsverktyg för att förutsäga cancerframkallande ämnen och undersöka cancerframkallande mekanismer (1). Att använda kronisk exponering för ett cancerframkallande ämne är dock tidskrävande och dyrt, vilket begränsar dess användning vid utveckling av läkemedel. Musmodeller är dock fortfarande mer attraktiva än stora djurmodeller på grund av den låga kostnaden, den enkla hanteringen och den kända genetiska informationen (2). På senare tid har en syngen musmodell som injicerats med murina cellinjer utvecklats (3). Fördelarna med denna modell är reproducerbarhet, förmåga att lätt inducera olika tumörtyper och immunokompetens. Å andra sidan visar denna modell ofta en annan respons jämfört med resultaten från in vitro-försök med mänskliga cancerceller. För att övervinna denna nackdel använde National Cancer Institute (NCI) en metod där mänskliga cancerceller injiceras i en immunbristande mus. Ett batteri av xenograftmodeller utvecklades från åtta olika NCI-cellinjer för cancer (hjärna, tjocktarm, leukemi, lungor, melanom, äggstockar, prostata och njurar). Dessutom har olika metoder för att skapa musmodeller fastställts för bedömning av nya läkemedels effektivitet och toxicitet. En modell är den genetiskt manipulerade musmodellen (GEMM), som är en avancerad metod för att utvärdera cancerogenesemekanismer och läkemedelsresistens (4). Immunokompetenta möss används för GEMM-modellen, i likhet med en syngen modell. Denna modell gör det alltså möjligt att tillämpa utveckling av immuna adjuvanter för cancer. Dessutom är denna modell användbar för att belysa biologiska processer och undersöka tumörceller och deras mikromiljö, men den är mycket dyr, heterogen och komplicerad. Dessutom sammanfaller inte tumörfrekvens, utveckling och tillväxt i GEMM-modellen (4-7). Många forskare har utarbetat en strategi för preklinisk utvärdering för att fastställa den terapeutiska potentialen och för att efterlikna den mänskliga tumörmiljön. Förutom GEMM-modellen används i xenograftmodeller in vivo athymiska nakenmöss och SCID-möss (severe combined immune deficiency) för implantation av mänskliga cancerceller eller patienttumörvävnad i translationell forskning för kliniska prövningar (8,9). I denna översikt fokuseras typerna och egenskaperna hos xenograftmodeller för tumörer på användning vid utveckling av cancerläkemedel.

Ektopisk xenograftmodell för tumörer. I allmänhet injiceras humana cancerceller subkutant i bakbenet eller ryggen på möss (fig. 1A). I en ektopisk tumör xenograftmodell (ektopisk modell) skiljer sig den transplanterade platsen från de odlade cellernas ursprung. Den ektopiska modellen är den standardmodell för cancer som används för validering och bedömning i onkologiska studier. Efter det att cancercellinjer för screening av cancerbekämpande läkemedel etablerats vid NCI utvecklades xenograftmodeller som härstammar från dessa cellinjer. Sextio cellinjer från åtta organ användes för att skapa xenograftmodeller och information som t.ex. tumörens dubbleringstid och tumörigenicitetsgrad rapporterades (1). I tabell 1 var den reproducerbara takten för xenograftmodellen i humana cancercellinjer över 90 %. För utvärdering av ledande substanser som erhållits från ett in vitro-screeningtest visade denna modell att samma cancerceller kan vara användbara och förutsägbara, vilket är till hjälp för att välja ut en tillämplig cancersubstans för överföring till klinisk prövning.

Då en ektopisk modell kan användas för att enkelt övervaka tumörigenicitet och tumörtillväxt, har många forskare utnyttjat denna modell för utvärdering av effekt mot cancer (10-12). Tumörvolymen (V) beräknas utifrån tumörens största längd och kortaste längd (ekvation1). Utifrån flera parametrar baserade på dessa data kan antikanceraktiviteten utvärderas. Förhållandet mellan behandlad grupp (T) och kontrollgrupp (C) (optimal % T/C), tumörtillväxtfördröjning och tumörregression användes (13-15). Läkemedelsrelaterade dödsfall (DRD) och förändring av kroppsvikt som parametrar för toxicitet bestämdes. DRD var förmodad djurdöd inom 15 dagar, och över 20 % förlust av behandlade musars kroppsvikt jämfört med kontroll ansågs vara en negativ effekt.

Dessa parametrar hjälper till att dra fram huvudämnet från läkemedelsscreening. Ibland kan läkemedelssvar beroende på cancertyper jämföras utan individuella skillnader, eftersom två typer av cancerceller kan transplanteras spontant till samma mus och de två tumörerna kan visa skillnader i tillväxt (16). Dessutom är den ektopiska modellen mycket reproducerbar, homogen och lätt att använda.

Det är dock inte alla tumörer som kan användas som ett bedömningsverktyg eftersom vissa tumörer visar nekros under tumörutvecklingen och vissa tumörer inte är solida (osubstantiella). De immunsupprimerade möss som används för att göra djurmodeller representerar en annan mikromiljö än den för mänsklig cancer. Därför är bedömningen av invasion och metastasering begränsad i denna modell.

Orthotopisk xenograftmodell för tumörer. Alternativa modeller för bedömning av tumörkänslighet har utvecklats. Den ortotopiska xenograftmodellen för tumörer (ortotopisk modell) är ett avancerat verktyg, men bygger på en immunosuppressiv murin-mikromiljö. I den ortotopiska modellen transplanteras de mänskliga cancercellerna till samma ursprungsplats som tumören. Till exempel injicerades lungcancerceller direkt i musens lunga för den ortotopiska modellen (fig. 1B). I denna modell krävs en välutbildad expert med kirurgiska färdigheter för att säkerställa reproducerbarhet. Det är svårt att beräkna tumörigenicitetens take rate eftersom nästan alla tumörer utom melanom är osynliga för blotta ögat. Dessutom är ortotopiska modeller begränsade till mätning av tumörtillväxt utan offer till skillnad från subkutana ektopiska modeller. Hittills är avbildning den metod som valts för att övervaka utvecklingen av växande tumörer i ortotopiska modeller. För närvarande observeras ortotopiska modeller med cancercellinjer som uttrycker fluorescens eller luciferas genom optisk avbildning, datortomografi (CT) eller magnetisk resonanstomografi (MRI) (17). För att bedöma karcinogenes och bestämma tumörtillväxten utan offer krävs dyr utrustning, så tillgången till denna modell är begränsad. Icke desto mindre är denna modell kliniskt relevant för den patientliknande progressionsprocessen (t.ex. invasion). Enligt en rapport av Ho och hans kollegor visar ortotopiska tumörer snabbare tumörtillväxt i ett tidigt skede, angiogenes och blodkärlens hyperpermeabilitet jämfört med ektopiska tumörer (18). I vissa cancertyper observerades också metastasering. Till exempel är den ortotopiska modellen för implantat av tumörer i bröstfettkudden också en bra modell för bröstcancer. I denna modell liknar spontana tumörmetastaser den naturliga utvecklingen av mänsklig bröstcancer (19). Därför kan antikanceraktivitet och metastashämning utvärderas i samma modell. Metastaseringsmodellen beskrivs nedan i detalj.

Metastaserande cancermodell. Tumörer som bildas lokalt genom exponering för ultraviolett, joniserande strålning och karcinogener cirkulerar i kärl och lymfkörtlar via invasion och orsakar metastasering (sekundär cancer) på platser som är mottagliga för invasion. Enligt Pagets frö- och markhypotes initierar den primära cancercellen (fröet) metastasering i en lämplig miljö (marken), t.ex. i lungor, lever, ben, lymfkörtlar och hjärna (20). Den senaste forskningen har drivit på utvecklingen av metastashämmare och förebyggande läkemedel som bygger på studier av metastasens mekanismer, men det har inte funnits något prekliniskt utvärderingsverktyg för att definiera riktlinjer för att godkänna en klinisk prövning.

För att etablera en metastasemodell har olika metoder utvecklats och det finns två typer av humana xenograftmodeller. För det första, vid ortotopisk transplantation, ger transplanterade tumörceller upphov till primärtumören, tumören avlägsnas och sedan observeras metastasering. Till exempel transplanterades WM239-melanomceller till SCID-möss (severe combined immune deficiency) och primärtumören isolerades efter fyra veckor. Därefter observerades lungmetastaser (21). Den ortotopiska modellen gjordes av prostatacancerceller (DU145), och den borttagna lymfkörteln odlades och isolerade tumörceller återinjicerades i möss för att få en metastasemodell (22). För det andra injicerades cancerceller intravenöst i nakenmöss (fig. 1C) eller SCID-möss, där de cirkulerade som cancerstamceller och utlöste metastasering (23). Denna modell genereras snabbare än den förstnämnda modellen. I hybridmodellen mellan ektopisk och ortotopisk modell injiceras fluorescensuttryckande HT- 29-celler (mänsklig tjocktarmscancer) subkutant i den ektopiska platsen och flera bitar av HT-29-cellderiverade tumörer transplanteras in i tjocktarmen, och sedan observeras metastasering (24). Generellt sett är det lättare att få fram en metastasemodell i SCID-möss än i nakenmöss. Eftersom metastasering, liksom i den ortotopiska modellen, är svår att observera utseendemässigt förutom vid hudcancer (25), användes genetiskt manipulerade cellinjer (fluorescerande (24) eller luciferasuttryckande celler (26)) som övervakades med hjälp av optisk avbildning in vivo. Ofta används denna modell för terdiagnostik, vilket innebär avbildning med MRT eller positronemissionstomografi (PET) (27) för att samtidigt diagnostisera och bestämma lämplig behandling mot cancer. Hittills har riktlinjerna för att använda metastasering som ett bedömningsverktyg för läkemedelsutveckling inte fastställts. Ytterligare studier om reproducerbarhet, mekanismer som ligger till grund för metastasering och markörer behövs.

Patientavledd tumör xenograftmodell. Xenograftmodeller är trots sina fördelar begränsade i sin förmåga att visa hur en cancerpatient skulle reagera på en viss behandling. Det behövs en tillförlitlig förutsägelse av läkemedelsrespons i en klinisk prövning, och de nuvarande modellerna är inte tillräckliga. I ett försök att åtgärda bristerna i dessa modeller utvecklades och användes en patientavledd tumör xenograft (PDTX) (28,29). Eftersom PDTX innebär att vävnad från cancerpatienter transplanteras direkt till immunsupprimerade möss (fig. 1D) är genetisk information och immunohistologiska markörer korrelativa till patienten och kan användas för att utvärdera nya cancerläkemedel (30) och personliga cancerterapier. De flera fördelarna med PDTX kan sammanfattas på följande sätt: 1

Däremot har PDTX-modellen tekniska begränsningar och är dyr och tidskrävande. Framför allt ska färska exciderade primära mänskliga tumörer levereras från operationssalen till laboratoriet inom flera timmar. Samtidigt bör ett prov av de primära mänskliga tumörerna undersökas genom immunohistologisk analys. Därför är det nödvändigt att kirurgen, histologen och forskaren samarbetar. Därefter kan de ursprungliga primära mänskliga tumörerna jämföras med tumörvävnader från den passerade tumörtransplantaten. Dessutom krävs godkännande av en institutionell granskningsnämnd (IRB) eftersom användningen av tumörvävnad från patienter medför kliniska och etiska överväganden. Trots dessa ansträngningar är PDTX-utnyttjandegraden cirka 25 % (31-33), och det tar cirka tre månader att etablera PDTX till den första passagen (data visas inte). Liksom vid xenoorgantransplantation krävs den första transplantationen till SCID-möss för att undvika akut immunrejektion, och detta är dyrt. Dessutom är den volym tumörvävnad som härrör från patienten mycket begränsad, så antalet PDTX-populationer bör ökas genom passage av tumörvävnad. samtidigt bör varje passage av tumörvävnad analyseras histopatologiskt och jämföras med den ursprungliga vävnaden. Från och med den andra passagen kan nakenmöss användas. Bitarna av tumörvävnad kan frysas och bevaras i flytande kväve.

Trots dessa hinder finns den etablerade PDTX-modellen tillgänglig för validering av känslighet för cancerläkemedel och förutsägelse av patientens prognos. PDTX är förvisso en mycket lovande modell för personlig cancerbehandling. Följaktligen är globala forskningscentra angelägna om att upprätta en resursbank av PDTX. Under det senaste decenniet har PDTX-modellen utvecklats snabbt. Denna modell är ett lovande verktyg för utveckling av cancerläkemedel och prediktiva biomarkörer.