12.9.2 Cross-linking
Trotz der offensichtlichen Vorteile wirft die Verwendung biologischer Gerüste immer noch eine Reihe von Problemen auf, insbesondere ihren schnellen biologischen Abbau in vivo, Bedenken hinsichtlich der Immunogenität und unbeabsichtigte oder unvollständige Gewebereaktionen. Um diese Bedenken auszuräumen, wurden im Laufe der Jahrzehnte Vernetzungsmethoden eingesetzt. Die Quervernetzung spielt eine Rolle bei der Verlangsamung des biologischen Abbaus sowie bei der Beseitigung oder Verringerung der artenübergreifenden Reaktion auf Strukturproteine von ECM-Gerüsten (Courtman et al., 2001).
Der Erfolg der Quervernetzung lässt sich an der Entwicklung von bioprothetischen Herzklappen aus xenogenen Geweben ablesen. Die Abkehr von der Formaldehyd-Behandlung und die Einführung der Glutaraldehyd-Vernetzung von bioprothetischen Herzklappen gilt als großer Erfolg auf diesem Gebiet (Zilla et al., 2007). Durch die Vernetzung bleibt die nicht-thrombogene Oberfläche der bioprothetischen Herzklappen erhalten, die Antigenität wird reduziert und der Abbau verhindert, wodurch sich ihre Lebensdauer in vivo verlängert. Diese Form der Fixierung von bioprothetischen Herzklappen wird auch heute noch verwendet. Die Chromgerbung von Kollagen wird seit mehr als 100 Jahren zur Konservierung von Tierhäuten in der Lederindustrie verwendet (Covington, 1997). Der Prozess beinhaltet ionische, kovalente und Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Chromspezies und Kollagen. Diese Form der Stabilisierung von Biomaterialien wurde auch zur Herstellung von chromhaltigem Katgut als chirurgisches Nahtmaterial verwendet (Van Winkle et al., 1975). Es gibt verschiedene andere Formen von Vernetzungsmitteln, die hauptsächlich aus der Notwendigkeit heraus entwickelt wurden, die Leistung von bioprothetischen Herzklappen und Perikardgewebe in vivo zu verbessern und Misserfolge im Zusammenhang mit Verkalkung und Zytotoxizität zu überwinden. Die Palette der Vernetzungsmittel reicht von den bekannten Aldehyden (Formaldehyd und Glutaraldehyd) bis zu neueren bifunktionellen Vernetzungsmitteln wie Polyepoxyverbindungen und Hexamethylendiisocyanat. Zu den anderen modernen Vernetzungsmitteln gehören die Null-Längen-Vernetzer wie Acylazid und Carbodiimide (Khor, 1997). Obwohl die Glutaraldehyd-Vernetzung immer noch zur Stabilisierung biologischer Gerüste verwendet wird, werden derzeit neuere funktionelle und möglicherweise weniger zytotoxische Vernetzungsmethoden entwickelt. Dazu gehören mikrobielle Transglutaminase-Enzyme, die pflanzliche Verbindung Genipin und multifunktionale dendrimere Vernetzungen (Garcia et al., 2007b; Duan et al., 2007; Chang et al., 2002; Chan et al., 2008).
Der Trend geht weg von nicht abbaubaren Bioprothesen, die über das Leben des Patienten hinaus halten sollen, hin zu biologisch abbaubaren Gerüsten, die so konzipiert sind, dass sie im Laufe der Zeit in vivo umgebaut werden, um beschädigte oder kranke Organe zu reparieren (Brody und Pandit, 2007; Badylak, 2007). Der Abbau des Gerüsts sollte kontrolliert und parallel erfolgen, um der Geschwindigkeit der Geweberegeneration in vivo zu entsprechen (Burugapalli et al., 2007). Das für das Tissue Engineering verwendete biologisch abbaubare Gerüst muss auch die notwendige Funktion erfüllen, bis neu gebildetes Gewebe diese Funktion übernehmen kann. In einem idealisierten biologisch abbaubaren Gerüst scheiden Wirtszellen, die in das implantierte Gerüst eindringen und es besiedeln, neue extrazelluläre Matrix aus, um das ursprüngliche Gerüst zu ersetzen, das sich mit einer bestimmten Geschwindigkeit abbaut.
Es hat sich gezeigt, dass die Geschwindigkeit des In-vitro- und In-vivo-Abbaus eines biologischen Gerüsts durch den Grad der Vernetzung bestimmt werden kann (Burugapalli et al., 2007). Liang et al. (2004) untersuchten den Einfluss des Vernetzungsgrads auf die Gewebereaktion und das Regenerationsmuster unter Verwendung von azellulärem Rinderperikard, das mit Genipin vernetzt war. In einem subkutanen Rattenimplantationsmodell stellten sie fest, dass nicht und nur minimal vernetztes azelluläres Rinderperikard schnell abgebaut wurde, bevor sich neues Gewebe bilden konnte. Im Gegensatz dazu wurden bei dem mäßig vernetzten und dem hoch vernetzten Gerüst neue Kollagenbildungen beobachtet, obwohl dieser Prozess bei letzterem aufgrund seiner größeren Fähigkeit, dem Abbau zu widerstehen, auf die äußere Schicht des Gerüsts beschränkt war. Bei der Implantation ähnlicher Gerüste als Gefäßpflaster in einem Hundemodell (Chang et al., 2004) wurde eine intakte Endothelschicht auf der Innenseite des Transplantats gefunden, zusammen mit Wirtsfibroblasten und glatten Muskelzellen im azellulären Transplantat. Dies war bei dem in der Studie verwendeten, mit Glutaraldehyd vernetzten azellulären Rinderperikard in geringerem Umfang der Fall. Allerdings wurden bei beiden Gerüsttypen eine unbeabsichtigte Intimaverdickung und chondroide Metaplasie beobachtet. In einer anderen Studie wurden ähnliche mit Genipin vernetzte azelluläre Rinderperikardien zur Reparatur von Myokarddefekten in einem Rattenmodell des rechten Ventrikels verwendet (Chang et al., 2005). Auf der endokardialen Oberfläche wurde eine mit Endothelzellen bedeckte Intimaverdickung gefunden. Mesothelzellen wurden auch an den Außenflächen des Transplantats beobachtet, von denen man annimmt, dass sie der Adhäsion widerstehen. Glatte Muskelzellen, Neomuskelfasern, Neokollagen, Neoglykosaminoglykane und Neokapillaren wurden vier Wochen nach der Implantation innerhalb des Gerüsts beobachtet.
Gelatine wurde als Biomaterial zur Reparatur von Defekten peripherer Nerven verwendet (Mligiliche et al., 1999; Gamez et al., 2004). Abbaubare, aus Gelatine hergestellte und mit Genipin vernetzte Gerüste wurden als Füllmaterial in einer röhrenförmigen Siliziumkammer verwendet und dienten als extrazelluläre Matrix, um die Nervenregeneration über eine 10 mm große Ischiasnervlücke bei Ratten zu leiten (Liu et al., 2004). Es konnte gezeigt werden, dass die Reste der Füllung die Wanderung und Dehnung der Axone verhinderten (Verdu et al., 2002), was vermutlich auf die verlängerte Abbauzeit der Gelatinefüllung zurückzuführen war (Bigi et al., 2002; Liu et al., 2004). Wurde vernetzte Gelatine als röhrenförmiges Conduit (statt als Füllmaterial) zur Überbrückung ähnlicher Nervenlücken verwendet, fanden sich nach sechs Wochen, als das Conduit sich zu zersetzen begann und die Neovaskularisierung zunahm, regenerierte Nervenfasern mit größtenteils unmyelinisierten Axonen und umgebenden Schwann-Zellen über der Lücke (Chen et al., 2005). Im äußeren Bereich des regenerierten Nervs befand sich außerdem dichtes Narbengewebe. Nach der subkutanen Implantation wurde eine dünne Schicht fibröser Kapseln beobachtet, zusammen mit den erwarteten akuten und chronischen Entzündungsreaktionen.
Es wurde festgestellt, dass die Konzentration des vernetzten Materials den In-vivo-Abbau bestimmt, wenn vernetzte Gelatine-Tricalciumphosphat-Gerüste subkutan implantiert wurden (Yao et al., 2004). Weniger vernetztes Gerüst war mit einem höheren Abbau verbunden, während stark vernetztes Gerüst einen minimalen In-vivo-Abbau aufwies. Die Verwendung höherer Mengen an vernetztem Gerüst wurde auch mit einer verstärkten Bildung von fibrösen Kapseln in Verbindung gebracht, was auf die Zytotoxizität des vernetzten Gerüsts zurückgeführt wurde. Bei der Implantation ähnlicher Gerüste zur Reparatur von Schädelknochendefekten bei Kaninchen stellten die Autoren fest, dass die Gerüste allmählich abgebaut und durch neuen Knochen ersetzt wurden, auch wenn dieser Prozess nur an der Schnittstelle zwischen Knochen und Gerüst begrenzt war (Yao et al., 2005). Der gleiche Verbundstoff, der mit Glutaraldehyd vernetzt wurde, führte zu einer ähnlichen Reaktion (Chen et al., 1998). Im Laufe der Zeit kam es zu einer allmählichen Degradation des Verbundgerüsts, da die Gerüste durch neuen Knochen ersetzt wurden und azelluläre Matrix vom Rand des Defekts aus zentripetal abgelagert wurde. Auch wenn das Gerüst entscheidend sein mag, können andere Faktoren den Heilungsprozess beschleunigen. So konnte beispielsweise durch die Zugabe von hyperbarem Sauerstoff die Knochenneubildung erheblich gesteigert werden, wie durch radiologische und histomorphometrische Verfahren nachgewiesen wurde (Chen et al., 2004). Das Vorhandensein bioaktiver Faktoren wie BMP-2 in einem abbaubaren Gerüst induzierte subkutan und intramuskulär eine ektopische Knochenbildung und schien die Resorption durch die Wirkung von Osteoklasten zu beschleunigen (Liang et al., 2005; Takahashi et al., 2005; Kato et al., 2006; Yoneda et al., 2005).