Päpstliche Reformen.
Nach dem Tod von Pius IV. hatten die Anhänger strenger religiöser Regeln unter der Führung von Kardinal (später dem heiligen) Karl Borromäus, dem Neffen von Pius IV., keine Schwierigkeiten, ihn zum Papst zu machen (7. Januar 1566). Pius behielt seinen asketischen Lebensstil bei und begann sofort mit der Reformarbeit. Dekrete und Verordnungen wurden rasch erlassen; der päpstliche Hof wurde zu einem Muster an Nüchternheit; Prostituierte wurden aus der Stadt vertrieben oder in ein bestimmtes Viertel gesperrt; Strafen für Sonntagsschändung, Gotteslästerung und Tierhetzen wurden festgelegt; Kleriker, die Pfründe innehatten, wurden verpflichtet, bestimmte Zeiträume in ihren Verwaltungsbezirken zu verbringen; Mitglieder von Klöstern wurden gezwungen, gemäß ihrem Gelübde in strikter Abgeschiedenheit zu leben; der Unterricht im Katechismus, dem kurzen Handbuch, das die Grundsätze des Katholizismus darlegt, wurde angeordnet. Ein neuer Katechismus erschien 1566, gefolgt von einem verbesserten Brevier (die täglichen Gebete für Geistliche und Nonnen) und einem verbesserten Messbuch (ein Buch mit den Gebeten und Antworten für die Feier der Messe). Der Gebrauch von Ablässen – d.h. der Erlass zeitlicher Strafen für Sünden – und Dispensen von Gelübden wurde eingeschränkt, und das gesamte Bußsystem wurde reformiert.
Pius war ein erklärter Feind des Nepotismus. Zwar ernannte er einen Neffen zum Kardinal, doch durfte dieser keinen Einfluss haben, und der Rest der Familie wurde auf Distanz gehalten. Mit der Konstitution Admonet Nos (29. März 1567) verbot er die Wiedereinverleibung von Lehnsgütern, die an den Heiligen Stuhl zurückfallen sollten, und verpflichtete die Kardinäle durch einen Eid, dies zu beachten. Im März 1569 ordnete Pius die Ausweisung der Juden aus den Kirchenstaaten an, doch aus wirtschaftlichen Gründen durften sie unter erniedrigenden Bedingungen in Rom und Ancona bleiben. Im Februar 1571 wurden die Humiliati, ein korrupter Mönchsorden in Mailand, wegen eines Attentats auf den Erzbischof, Kardinal Borromeo, aufgelöst.
Die Regeln der Inquisition wurden verschärft; alte Anklagen, die lange ausgesetzt waren, wurden wiederbelebt; der Rang bot keinen Schutz, sondern setzte seinen Besitzer eher noch heftigeren Angriffen aus. Niemand wurde unerbittlicher verfolgt als die Intellektuellen, unter denen viele der protestantischen Lehren Anklang gefunden hatten. Fürsten und Staaten zogen ihren Schutz für Ketzer zurück und warben um die Gunst des Heiligen Stuhls, indem sie angesehene Straftäter auslieferten. Philipp II. von Spanien lieferte 1566 Bartolomé de Carranza aus, den spanischen Theologen und ehemaligen Beichtvater von Königin Maria von England, und Cosimo de Medici lieferte 1567 Pietro Carnesecchi aus, den florentinischen Ketzer, der schon während des Pontifikats von Paul IV. verdächtigt worden war (und erhielt zwei Jahre später als Belohnung den Titel eines Großherzogs der Toskana). Im März 1571 wurde die spezielle Kongregation des Index, eine Liste von Büchern, die als Gefahr für den Glauben und die Moral verurteilt wurden, unabhängig von der Inquisition eingerichtet, und Hunderte von Druckern flüchteten in die Schweiz und nach Deutschland. Pius bedauerte, dass er manchmal zu nachsichtig gewesen war. Er ermutigte Philipp II. von Spanien, die rücksichtsloseste Tyrannei anzuwenden, um seine holländischen Untertanen im katholischen Glauben zu erhalten, und schickte Truppen nach Frankreich, um Katharina de Médicis bei der Unterdrückung der Hugenotten zu helfen; er protestierte gegen die Toleranz des römischen Kaisers Rudolf II.