Free Press

Amellett, hogy az l-laktát a májban és a vesében glükóz prekurzor, ma már a legtöbb sejtben energiaszubsztrátként is felismerik a piruváttá történő oxidációja révén. Ezt az oxidációt, amely feltételezhetően a citoszolban történik, az l-laktát-dehidrogenáz katalizálja, a piruvát pedig ezt követően a mitokondriumokban katabolizálódik. Nemrégiben azonban felismerték, hogy a mitokondriumok is szerepet játszanak az l-laktát-metabolizmusban: Dianzani (1) felvetette egy mitokondriális l-laktát-dehidrogenáz (m-l-LDH) létezését, majd később Baba és Sharma (2) kimutatta, hogy a mitokondriális mátrixban található (3). Az l-laktát transzportját és metabolizmusát valóban kimutatták különböző mitokondriumokban, többek között a vázizomban (4), patkányszívben (5), májban (6), agyban (7-9), kisagyi szemcsesejtekben (10), nyúl gastrocnemiusban (11), spermiumsejtekben (12), sertésmájban (13) és még a növényben is (14). Így az m-l-LDH létezését, amint azt Passarella és munkatársai (3), Brooks (15) és Schurr (16) áttekintették, a MitoCartába (http://www.broadinstitute.org/pubs/MitoCarta/index.htrnl) való felvételével ismerték el. A várakozásoknak megfelelően, tekintettel az l-LDH jelenlétére a mátrixban, az l-laktát hordozóinak előfordulását kimutatták a tisztított, kapcsolt mitokondriumokkal végzett funkcionális vizsgálatokban. Ezek közé tartozik az l-laktát/H+ szimporter és az l-laktát/piruvát és l-laktát/oxalacetát antiporterek (3). Meglepő módon a mitokondrium belsejében elhelyezkedő m-l-LDH elsöprő bizonyítéka nem általánosan elfogadott, egyes tudósok még mindig szkeptikusak az m-l-LDH létezésével kapcsolatban, míg mások az intermembrán térben lokalizálják az m-l-LDH-t (17). Véleményünk szerint a szkepticizmus a kapcsolt mitokondriumok izolálásának nehézségeiből eredhet, ami nem könnyű feladat, különösen a vázizomminták esetében, vagy abból, hogy nem elég körültekintő a reakcióközegek kiválasztása és a megfelelő koncentrációjú inhibitorok használata (11). Azt, hogy az m-l-LDH a mitokondriumokban lokalizálódik, az alábbiakban mutatjuk be.

Az l-laktátot a rákos sejtek mitokondriumaiban szállítják és metabolizálják?

Igen, így van. Bár az 1920-as években Warburg megállapította, hogy a rákos sejtek inkább glikolízissel termelnek ATP-t l-laktáttermeléssel, legjobb tudomásunk szerint az l-laktát mitokondriális anyagcseréjét nem vizsgálták rákos sejtekben egészen 2010-ig, amikor is megjelent az első bizonyíték az l-laktát mitokondriális anyagcseréjére ezekben a sejtekben (amelyről már 2008-ban beszámolt Gabriella Chieppa a Molise Egyetemen írt PhD-dolgozatában) (18). Ebben az esetben a normál és rákos prosztata sejtekből izolált mitokondriumokban történő l-laktát-transzport és -anyagcsere tanulmányozására spektroszkópiai és polarográfiás technikákat alkalmaztak, amelyekben vagy az m-l-L-LDH reakciót, vagy a külsőleg hozzáadott l-laktáttal táplált mitokondriumok oxigénfogyasztását követték nyomon (19), ahelyett, hogy a molekuláris biológiai, genetikai és kémiai laboratóriumokban rendelkezésre álló bonyolultabb eljárásokat alkalmazták volna. Az előbbi két technikát választottuk, mivel ezek lehetővé teszik a vizsgált folyamatok kinetikájának folyamatos nyomon követését olyan, több percig tartó kísérletekben, amelyekben a mitokondriumok összekapcsolva maradnak. Ezzel szemben az utóbbi módszerekkel végzett mérések általában akkor történnek, amikor a folyamatok már befejeződtek. Ennek megfelelően az intramitokondriális piridin-nukleotidok redoxállapotának fluorimetriás mérésekkel kimutatott növekedése az l-laktát mitokondriumokhoz való hozzáadásakor arra utal, hogy az l-laktát-metabolizmus a szerveztek belsejében zajlik egy NAD+-függő m-l-LDH-n keresztül; sajnos a mitokondriális l-laktát-metabolizmus rákos sejtekben való előfordulását nem idézte a Ferguson et al. (17) valószínűleg azért, mert az áttekintés szerzői a spektroszkópiai és polarográfiás technikát “problematikusnak” tartják, annak ellenére, hogy számos tudós széles körben használja. Azt, hogy az ő véleményük kisebbségi vélemény, talán jól példázza egy idézet Mayevsky és Rogatsky (20) áttekintéséből, amely szerint “A különböző csoportok által publikált nagyszámú közlemény tanúskodik a különböző kísérleti körülmények között gyűjtött értékes információkról. A szövetek NADH-szintjének megfigyelése a legfontosabb információt a mitokondriumok metabolikus állapotáról szolgáltatja”. Az m-l-LDH létezése immunológiailag is igazolható olyan mitokondriumokban, amelyek bizonyítottan mentesek a citoszolikus szennyeződéstől.

Megjegyezzük, hogy abban az esetben, amikor az m-l-LDH lokalizációját a membránközi térben javasolják, az intramitokondriális piridin nukleotid fluoreszcencia növekedése a következőképpen magyarázható: az l-laktát belép a mitokondriális intermembrán térbe, ahol piruváttá oxidálódik, amely viszont áthalad a mitokondriális belső membránon, hogy a piruvát-dehidrogenáz komplexen keresztül a mitokondriumon belül oxidálódjon . Ezt a mechanizmust különböző kísérleti eredmények nem támasztják alá. Például de Bari és munkatársai (18) kimutatták, hogy a NAD+ redukció a piruvát-dehidrogenáz inhibitorának, az arzenitnek a jelenléte ellenére is folytatódik, de az oxamát, az l-LDH inhibitora gátolja. További bizonyítékot szolgáltatnak az m-l-LDH intermembrán térben való jelenléte ellen azok a kísérleti eredmények, amelyek azt mutatják, hogy az l-laktát olyan körülmények között jut be a mitokondriumokba, amikor a piruvát nem penetráns vegyület (21), vagy amikor a piruvát/H+ szimportert gátolja egy inhibitor (6). Ezek a kísérleti megközelítések a jövőben az oxigénfogyasztás (ADP jelenlétében vagy hiányában), a protonkiáramlás és a membránpotenciál generálásának mérésére is alkalmazhatók. A kontrollerősség kritériumának különböző, nem penetráns inhibitorokkal történő alkalmazásával (19) megállapítható, hogy a fenti folyamatok sebessége tükrözi-e a mitokondriális membránon keresztüli l-laktát-transzport sebességét vagy sem. Így az l-laktát-transzport kvantitatív módon vizsgálható, beleértve a hiperbolikus kinetika előfordulását, a pH-profilt stb. Továbbá a piruvát- és az l-laktát-függő mitokondriális folyamatok gátlási profiljai között a mitokondriumokba bejutni nem képes vegyületek alkalmazásával végzett összehasonlítás lehetővé teszi az l-laktát- és piruvát-hordozók megkülönböztetését.

Röviden azt is kimutatták, hogy a kívülről hozzáadott l-laktát mind a normál, mind a rákos prosztata sejtekbe bejuthat, és különösen a hordozó által közvetített módon jut be a mitokondriumokba, ahol létezik egy l-LDH, amely a belső kompartmentben található. Az m-l-LDH-k bizonyítottan különböznek a citoszolikus enzimektől, amelyek maguk is különböznek egymástól. A normál és a rákos sejtek különbséget mutatnak az m-l-LDH fehérjeszintje és aktivitása tekintetében, ahol mind az enzim expressziója, mind az aktivitása magasabb a rákos sejtekben.

2011-ben kimutatták a monokarboxilát transzporter (MCT) és az LDH fehérjék létezését az emlőrákos sejtvonalak mitokondriális retikuláiban (22). Ebben az esetben mind az MCT-k, mind az l-LDH expresszióját megmértük, és mitokondriális lokalizációjukat immunfluoreszcenciával határoztuk meg, amely technika nem teszi lehetővé a szubszubjektokondriális lokalizáció azonosítását.

A rákos sejtek mitokondriumaiban zajló l-laktát-transzport és -anyagcsere szélesebb körű vizsgálatát humán hepatocelluláris karcinóma (Hep G2) sejtekben végeztük (21), amelyekben glükoneogenezis zajlik (23). A Hep G2 sejtek mitokondriumai (Hep G2-M) a belső mitokondriális kompartmentre korlátozódó m-l-LDH-val rendelkeznek. A citoszolikus és a mitokondriális l-LDH-k telítési kinetikája is különbözik egymástól. Kimutatták a hordozó által közvetített l-laktát-transzport előfordulását is ezekben a mitokondriumokban. Fontos, hogy először mutatták ki a különböző metabolitok, köztük a piruvát, az oxalacetát, a malát és a citrát mitokondriumokba történő l-laktát-addícióból eredő kiáramlását, ami első ízben adott betekintést az l-laktát mitokondriális metabolizmusának szerepébe; ennek megfelelően kimutatták a citoszolikus NADH oxidációjának szentelt l-laktát/piruvát transzfer előfordulását is. Végső soron az oxidációs termék hordozó által közvetített transzport és mitokondriális metabolizmus révén történő eltávolítása legyőzi az elméleti termodinamikai nehézségeket, amelyekről úgy vélték, hogy kizárják az l-laktát oxidációját a mitokondriumokban.

Ezek az eredmények határozottan arra utalnak, hogy a glükózanyagcseréről alkotott dogmatikus nézet felülvizsgálatára van szükség, különös tekintettel az l-laktát és az m-l-LDH szerepére a glükoneogenezisben. Ezért a Cori-ciklus (amelyet 1929-ben fogalmaztak meg, mint az állatok energiaigényes anyagcsere-útvonalát, ahol a glükóz szénatomjai körkörös úton haladnak: izomglikogén → vérlaktát → máj (ahol a glükoneogenezis zajlik) → vércukor → izomglükóz → izomglikogén) szintén felülvizsgálatot igényel. E tekintetben a celluláris l-laktát-oxidációt, amely a Cori-ciklusban a glükóz előállításához szükséges, hagyományosan úgy posztulálták, hogy a citoszolban zajlik, de vajon így van-e? A citoszolikus-l-L-LDH (c-l-LDH) egy redukáló enzim, a glikolitikus útvonal utolsó lépése, amely a piruvátot l-laktáttá alakítja, és így biztosítja a NAD+ regenerációját. Ennek a reakciónak az oxigén jelenlététől vagy hiányától függetlenül zavartalanul kell lejátszódnia, mivel a piruvát l-laktáttá történő átalakulásának standard szabadenergia-változása (ΔG0′) körülbelül -6 kcal/mol. Ezenkívül a piruvát nagy affinitása a c-l-LDH-hoz megmagyarázná azt a tényt, hogy a vérben és más szövetekben a normál / arány >10, egy olyan érték, amely nem felelhet meg a piruvátnak mint a glikolízis végtermékének normál körülmények között történő javaslatának. Ezért e reakció kétirányúként való dogmatikus ábrázolása félrevezető, és a lehetséges alternatíva hiányában mindeddig elfogadott. Azt állítjuk, hogy az l-laktát piruváttá történő visszaalakítása nem a citoszolban, hanem a mitokondriumokban történik. Valójában csak két lehetőség van az l-laktát citoszolban való felhalmozódásának megakadályozására: az l-laktátot vagy ki kell szállítani a sejtből (anaerob körülmények között) és/vagy a mitokondriumba történő szállításakor (aerob körülmények között) az m-l-LDH-n keresztül oxidálni kell. Ezért, még ha egyet is értünk Lu és munkatársaival (24) abban, hogy “a glikolízisből származó piruvát nagy része a laktátfermentációra irányul”, nem fogadhatjuk el, hogy az l-laktát “távol marad a mitokondriális oxidatív metabolizmustól.”

Különös érdekesség, hogy a piruvát nem tud bejutni a Hep G2-M-be. Valójában, ellentétben a malát + glutamáttal és az l-laktáttal, a külsőleg hozzáadott piruvát nem okoz sem oxigénfogyasztást, sem membránpotenciál generálást . Megjegyzendő, hogy a piruvát transzportjának károsodásáról a rákos sejtekben Paradies és munkatársai (25) számoltak be. Ezért, függetlenül az l-laktát oxidáció elméleti megvalósíthatatlanságától a citoszolban, amint azt fentebb kifejtettük, a klasszikus Cori-ciklus nem játszódhat le a Hep G2sejtekben. Ezért egy felülvizsgált Cori-ciklust ajánlunk (1. ábra), amely magában foglalja mind az l-laktát-függő forgalmat közvetítő mitokondriális hordozókat, mind az m-l-LDH-t, amely a mitokondriumokon belül biztosítja a piruvátot. Ennek megfelelően az l-laktát felvételéből és metabolizmusából származó oxalaktát és malát megjelenése a mitokondriumokon kívül az m-l-L-LDH, a piruvát-dehidrogenáz, a piruvát-karboxiláz és a malát-dehidrogenáz, valamint a cserék révén, valószínűleg az l-laktát/oxalaktát és l-laktát/malát antiportereknek köszönhetően, megerősíti az l-laktát anaplerotikus szerepét a glükoneogenezisben, amelyben a mitokondriumok egyedülálló szerepet játszanak. Fontos, hogy az l-laktát hozzáadása a Hep G2-M-hez a zsírsav prekurzor, a citrát megjelenését eredményezi a mitokondriumokon kívül. Ennek megfelelően nagyfelbontású tömegspektrometria segítségével megállapították és bizonyították, hogy az l-laktát felvétele a HeLa- és H460-sejtek mitokondriumaiba lipidszintézist eredményez; emellett transzmissziós elektronmikroszkópia megerősítette, hogy az LDH a mitokondriumokban lokalizálódik (26). Meglepő módon az l-laktát mitokondriális anyagcseréjének anaplerotikus szerepét nem vették figyelembe, amikor a rákos anyagcserét “újra megvizsgálták” (27).

Úgy véljük, hogy a Cori-ciklus javasolt felülvizsgálatát, amely a Hep G2 sejtek esetében szükséges, minden más sejttípusban is figyelembe kell venni, ahol az l-laktát mitokondriális metabolizmusa aktív. Például a mitokondriális l-laktátfelvételből/metabolizmusból eredő in vitro glükoneogenezis részleges rekonstrukcióját mutatták ki a mitokondriumokon kívüli LDH hiányában (6).

A mitokondriális l-laktát-metabolizmus szerepe további figyelmet érdemel: tekintettel arra, hogy a tumor mikrokörnyezetében a hidrogén-peroxid-termelés táplálja a rákos sejtek anabolikus növekedését (28), meg kell vizsgálni a feltételezett mitokondriális l-laktát-oxidáz (LOX) lehetséges szerepét, amely hidrogén-peroxidot termel a patkánymáj mitokondriumaiban (29); a LOX létezése a Hep G2-M-ben összhangban tűnik azzal a bizonyítékkal, hogy a rotenon, amely gátolja a malát + glutamát hozzáadásával indukált oxigénfogyasztást, nem gátolja az l-laktát hozzáadásával indukált oxigénfogyasztást.

A szerzők közreműködése

SP fogalmazta meg ezt a véleményt, megosztotta azt és írta a tanulmányt AS-szel.

Enyilatkozat az összeférhetetlenségről

A szerzők kijelentik, hogy a kutatást olyan kereskedelmi vagy pénzügyi kapcsolatok hiányában végezték, amelyek potenciális összeférhetetlenségként értelmezhetők.

A bíráló a kezelőszerkesztőnek nyilatkozott az egyik szerzővel való közös, együttműködés nélküli kapcsolatról.